試驗原理：

是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將待測物質和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中待測物質的濃度呈比例關系。
分析類型：夾心ELISA

樣本類型：血清、血漿、組織、尿液、及相關液體等樣本

產品型式：48/96孔板，可拆

貯存方法：試劑盒未拆開，4℃保存。已拆開，標準品-20℃保存，其它4℃保存。

運輸條件：4℃

樣本體積：50μl
自備材料

1）蒸餾水。

2）酶標儀(450nm）

3）高精度加樣及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

4）振蕩器及磁力攪拌器等。5）37℃恒溫箱。

 
安全性

1）避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2）實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。


樣品收集、處理及保存方法

1）血清－－－－-操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2）血漿－－－－-EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3）細胞上清液－－-1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4）組織勻漿－－－－-將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液

5）保存－－－－－－如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

 
試劑的準備

1）標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。

2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

 
操作步驟

1）使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。

2）根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內。

3）加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8）取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

9）在450nm波長處測定各孔的OD值。

 

局限

6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到精確的結果。

 
性能

1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應。

3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

 

結果判斷與分析

1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的待測物質標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的待測物質含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

 
實驗原理: 用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗體的微孔中依次加入標本或者標準品、生物素化的抗體、HRP-標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物顯色。底物在過氧化物酶的催化下轉化成藍色， 并在酸的作用下轉化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣品中的目標蛋白呈正相關。用酶標儀在（450nm）波長下測定測定OD值（吸光度），計算樣品濃度。