Western Blotting技術服務

WESTERN BLOT是以電泳分離組分，將其從凝膠轉移到一種固相支持體，繼之以針對特定氨基酸序列的特異性抗體作為探針檢測目的蛋白的一種分子生物學技術。  

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

我司為您提供全套免疫印跡(immunoblotting)技術服務，全部實驗皆使用高質量試劑完成

●主要實驗步驟如下：  

1. 蛋白質抽提

   a.實驗對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。

   b.實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。  

2. 蛋白質定量

   按KCTMBCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

3. 變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE)  

   將準備好的樣品液和生物素標記的蛋白質分子量標準分別上樣，標準加進第一個孔中，電泳分離蛋白。

4. 蛋白質轉移到硝酸纖維膜或PVDF膜

   按Bio-Rad蛋白轉移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉移過夜。

5. 膜的封閉和抗體孵育

   a. 膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。

   b. 封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育1.5小時，抗原抗體結合。  

   c. 加入HRP標記的二級抗體以結合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結合分子量標準，室溫孵育膜1小時。加入HRP標記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。

6. 結果檢測

   化學發光法檢測，膜與化學發光底物孵育，經X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化。

7. 數據分析

   目的蛋白的灰度值除以內參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

8. 提供實驗報告

   包括詳細的實驗方法及免疫印跡實驗結果的相關圖表。

客戶方需提供：

1、 第一抗體(建議客戶定購國外公司的一抗，以國外文獻中應用的相關第一抗體為佳。

   如Cell signaling technology, Cayman Chemical, Santan Cruz, Zymed等著名抗體公司。)

2、 預實驗樣本

3、 正式實驗樣本

   同時希望客戶能提供相應的背景材料以利實驗順利完成，背景材料包括：樣本描述，目的蛋白相關資料，必要的相關實驗設計內容如陽性對照等等。

★ 公司方提供：

1、 預實驗結果

2、 正式實驗結果

  如客戶只需要進行預實驗研究，我方可只代理預實驗業務并提供結果。

★ 實驗周期與費用：

   預實驗的費用以欲檢測目的蛋白的種類數目（或第一抗體種類數目）計算，公司將在材料和實驗經費全部到位的工作日后15個工作日之內提交實驗結果。正式實驗費用欲檢測目的蛋白的種類數目（或第一抗體種類數目）和樣本數為單位計算，實驗周期為20個工作日，公司將在材料和預付的實驗經費全部到位的工作日后20個工作日之內提交實驗結果。如客戶要求在10個工作日之內完成，每單位樣品費用為常規周期的兩倍。實驗結果以膠片的形式提交給客戶，客戶需在收到實驗結果后一周內付清所有剩余款項。